DB6521∕T 074-2024 SSR分子标记鉴定甜瓜杂交种纯度技术规程(吐鲁番市)
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ID： |
FFFC5FA0E6DE467AAFA6E3DC83A5EBBC |
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文件大小(MB)： |
0.33 |
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11 |
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日期： |
2024/9/3 |
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ICS 65.020.01,CCS B 21 6521,吐鲁番市地方标准,DB 6521/T 074—2024,SSR 分子标记鉴定甜瓜杂交种纯度,技术规程,Technical specification for purity identification of melon varieties,by SSR marker method,2024 - 05 - 17 发布2024 - 06 - 17 实施,吐鲁番市市场监督管理局 发布,DB 6521/T 074—2024,I,前言,本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定,起草,请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任,本文件由新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所提出,本文件由吐鲁番市农业农村局归口,本文件起草单位：新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所、新疆葡萄瓜果技术开发服务公司、新疆维吾,尔自治区种业发展中心、新疆农业广播电视学校,本文件主要起草人：李超、杨英、陈伟、杨咪、孙玉萍、杨军、耿新丽、徐畅、赵文霞、李婧、程,晓宇、张银欢,本文件实施应用中的疑问，请咨询新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所,对本文件的修改意见、建议，请反馈至新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所（鄯善县苗园路4号）、,吐鲁番市市场监督管理局（吐鲁番市高昌区西环北路2712号）,新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究所（鄯善县苗园路4号），联系电话：0995-8389233，邮编：838200,吐鲁番市市场监督管理局（吐鲁番市高昌区西环北路2712号），联系电话（传真）：0995-8566246,邮编：838000,DB 6521/T 074—2024,1,SSR 分子标记鉴定甜瓜杂交种纯度技术规程,1 范围,本文件规定了甜瓜品种纯度SSR（simple sequence repeat，SSR）分子标记鉴定的原理、仪器设备和,PCR反应相关试剂、方法步骤和纯度计算的要求,本文件适用于甜瓜杂交种纯度鉴定,2 规范性引用文件,下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本,文件,GB/T 3543.1 农作物种子检验规程总则,GB/T 3543.2 农作物种子检验规程扦样,GB/T 3543.5 农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定,GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法,3 术语和定义,下列术语和定义适用于本文件,3.1 品种纯度purity of variety,指品种在特征方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检作物种子数的百分率表示,3.2 简单重复序列simple sequence repeat(SSR),由几个核苷酸（1～6 个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个bp（一般为100～200）的串,联重复序列，又称微卫星序列或短串联重复序列，其高度多态性主要来源于串联数目的不同,3.3 聚合酶链式反应polymerase chain reaction(PCR),利用DNA在体外95℃高温变性成单链，低温（通常是55℃～60℃）时引物与单链按碱基互补配对,的原则结合，温度再调至DNA聚合酶最适反应温度（72℃），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5′～3′）,的方向合成互补链,3.4 引物primer,DB 6521/T 074—2024,2,人工合成的两段寡核酸序列。一个引物与目的基因一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与目,的基因另一端的另一条DNA模板链互补,4 原理,品种的不同本质上是由于其遗传物质DNA核苷酸序列不同所致。SSR广泛分布于甜瓜整个基因组中,根据微卫星序列两段互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段。由于核心序列串联重复数目不,同造成了品种间的多态性，通过PCR的方法扩增出不同长度的扩增产物，将扩增产物进行凝胶电泳，在,电场作用下由于分子量大小不同而分离，再经硝酸银染色，可辨别SSR电泳图谱。SSR分子标记呈共显,性，选用品种间具有多态性的SSR引物，杂交种F1代种子的DNA-PCR扩增产物谱带中应具有双亲谱带,以此鉴定甜瓜杂交种种子纯度,5 仪器设备及试剂,仪器设备及试剂见附录A,6 溶液配制,溶液配制方法见附录B,7 引物,引物相关信息见附录C,8 操作程序,8.1 样品准备,取200粒种子，催芽,8.2 DNA 提取,8.2.1 总则,DNA提取方法应保证提取的DNA质量符合PCR扩增的要求，DNA溶解液的紫外光吸光度OD260与,OD280的比值应介于1.8～2.0之间,DNA提取可任选8.2.2与8.2.3中的一种方法。其中改良CTAB法提取量大，质量好，可长期保存；碱,裂解法简单快速，但提取量小，质量一般，不宜保存,8.2.2 改良CTAB 法提取DNA：,a) 将样品置于2.0 mL 离心管，液氮冷冻后，迅速研磨成粉末；,b) 加入800 μL 2%的CTAB，混合均匀后，65oC 水浴30 min，每10 min 轻轻上下摇晃5～10 次；,DB 6521/T 074—2024,3,c) 加入800 μL 的氯仿∶异戊醇为24∶1 的混合液，上下颠倒200 次；,d) 8,000 rpm 离心10 min，抽取上清液到一个新的离心管中；,e) 加入2/3 体积的异丙醇，上下颠倒200 次，混匀；,f) 12,000 rpm 离心10 min，此时DNA 成白色团装聚于管底，弃去上清；,g) 用75%乙……
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